裸鼠皮下成瘤模型構(gòu)建

一、模型構(gòu)建流程與核心技術(shù)

1. 實(shí)驗(yàn)動物選擇

• 品系選擇：

• 常用品系：BALB/c nu/nu裸鼠（T細(xì)胞缺陷）、NOD-SCID（T/B/NK細(xì)胞缺陷）、NSG（NOD-SCID-IL2Rγ-/-，全免疫缺陷）。

• 性別與周齡：優(yōu)先選擇雄性裸鼠（6-8周齡，體重18-20 g），減少激素干擾。

• 飼養(yǎng)條件：SPF級環(huán)境，溫度22-25℃，濕度40-70%，12小時光照/黑暗周期。

2. 腫瘤細(xì)胞準(zhǔn)備

• 細(xì)胞株選擇：

• 高成瘤細(xì)胞：HCT-116（結(jié)直腸癌，成瘤率100%）、SKOV3（卵巢癌）、SGC-7901（胃癌）。

• 爭議性細(xì)胞：如Hep-G2（肝癌）需高細(xì)胞密度（1×10? cells/只）接種。

• 細(xì)胞預(yù)處理：

• 傳代要求：取對數(shù)生長期細(xì)胞（活力>95%），胰酶消化后離心（1000 rpm，5分鐘），重懸于PBS或基質(zhì)膠（Matrigel）中（體積比1:1）。

• 濃度調(diào)整：常規(guī)接種濃度1×10?~1×10? cells/mL（具體依細(xì)胞株特性調(diào)整）。

3. 皮下接種操作

• 注射部位：

• 腋下：右腋皮下（淋巴引流明確，便于觀察轉(zhuǎn)移）。

• 背部：中線兩側(cè)（避免動物抓撓）。

• 操作步驟：

1. 麻醉：1%戊ba比妥鈉（50 mg/kg）或異氟烷吸入麻醉。

2. 注射：使用1 mL注射器（22-25G針頭），緩慢注入0.1-0.2 mL細(xì)胞懸液（避免滲漏）。

3. 退針后輕壓注射點(diǎn)，防止細(xì)胞液反流。

4. 術(shù)后監(jiān)測與數(shù)據(jù)記錄

• 成瘤時間：

• 快速成瘤型：HCT-116（7天可見結(jié)節(jié)）。

• 慢速成瘤型：原代細(xì)胞或低侵襲性細(xì)胞需2-4周。

• 監(jiān)測指標(biāo)：

• 腫瘤體積：游標(biāo)卡尺測量長徑（L）和短徑（W），按公式V=1/2×L×W2計算。

• 動物狀態(tài)：體重變化、活動度、腫瘤潰瘍情況。

二、模型評價體系與驗(yàn)證方法

1. 成瘤率與生長曲線

• 成功標(biāo)準(zhǔn)：瘤體體積≥100 mm3（通常接種后2-4周）。

• 生長曲線分析：繪制腫瘤體積-時間曲線，計算倍增時間（如HCT-116約3天）。

2. 組織病理學(xué)驗(yàn)證

• HE染色：觀察腫瘤細(xì)胞異型性、核分裂象及間質(zhì)浸潤。

• 免疫組化：檢測Ki-67（增殖指數(shù)）、CD31（微血管密度）等標(biāo)志物。

3. 分子生物學(xué)檢測

• 基因表達(dá)：qPCR或Western blot驗(yàn)證目標(biāo)基因（如PRDX4、ASAP1）在瘤體中的表達(dá)。

• 信號通路分析：檢測PI3K/AKT、VEGF等通路關(guān)鍵蛋白。

4. 功能成像技術(shù)

• 小動物PET/CT：18F-FDG示蹤腫瘤代謝活性。

• 活體熒光成像：適用于標(biāo)記熒光素酶（Luc）的腫瘤細(xì)胞。

三、技術(shù)優(yōu)化與常見問題解決

1. 提高成瘤率的策略

• 細(xì)胞預(yù)處理：

• 基質(zhì)膠混合：增強(qiáng)細(xì)胞黏附與血管生成（如SKOV3聯(lián)合Matrigel）。

• 低溫操作：細(xì)胞懸液全程冰上保存，減少凋亡。

• 動物選擇優(yōu)化：

• 年輕裸鼠：4-6周齡代謝活躍，成瘤更快。

• 免疫強(qiáng)化品系：NSG小鼠適用于低成瘤性細(xì)胞。

2. 常見問題與解決方案

3. 特殊模型構(gòu)建技巧

• 原位移植模型：

• 皮下傳代后切取瘤塊（1 mm3）移植至靶器官（如胃壁），模擬轉(zhuǎn)移。

• 基因編輯模型：

• CRISPR/Cas9敲除目標(biāo)基因（如KMT2D）后接種，研究基因功能。

四、應(yīng)用場景與案例分析

1. 抗腫瘤藥物篩選

• 案例：卡培他濱抑制HCT-116裸鼠瘤體生長，腫瘤體積減少60%。

• 評價指標(biāo)：瘤重抑制率=（對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重）/對照組瘤重×100%。

2. 基因功能研究

• 案例：sh-PRDX4組瘤體體積較對照組下降50%，證實(shí)PRDX4促癌作用。

• 驗(yàn)證方法：shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染+皮下成瘤。

3. 轉(zhuǎn)移機(jī)制探索

• 案例：過表達(dá)miR-449a抑制Bel-7402肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移灶減少80%。

• 技術(shù)延伸：結(jié)合淋巴結(jié)解剖與HE染色分析轉(zhuǎn)移率。

五、倫理規(guī)范與實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1. 倫理原則

• 3R原則：

• 替代（Replacement） ：優(yōu)先使用體外模型預(yù)實(shí)驗(yàn)。

• 減少（Reduction） ：每組≥5只裸鼠（統(tǒng)計學(xué)意義）。

• 優(yōu)化（Refinement） ：術(shù)中麻醉+術(shù)后鎮(zhèn)痛（布洛芬5 mg/kg）。

2. 實(shí)驗(yàn)記錄標(biāo)準(zhǔn)化

• 數(shù)據(jù)記錄：詳細(xì)記錄接種時間、細(xì)胞批次、動物編號。

• 病理存檔：瘤體福爾馬林固定或液氮凍存，供后續(xù)分析。

六、總結(jié)與未來方向

裸鼠皮下成瘤模型因其操作簡便、成本可控和高重復(fù)性，成為腫瘤研究的核心工具。未來發(fā)展趨勢包括：

1. 多組學(xué)整合：單細(xì)胞測序解析瘤內(nèi)異質(zhì)性。

2. 動態(tài)監(jiān)測技術(shù)：納米探針聯(lián)合micro-CT實(shí)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶無創(chuàng)檢測。

3. 人源化升級：PDX（人源腫瘤異種移植）模型替代傳統(tǒng)CDX模型，提高臨床預(yù)測性。